方案概述
前言：
亞硝胺雜質是一類具有亞硝基與胺結合（R1N(-R2)-N=O）的化學結構的化合物，具有高潛在致突變致癌性。自華海纈沙坦事件以來，多種藥品中相繼檢出小分子亞硝胺類雜質（如NDMA、NDEA、NDBA等）或與原料藥相關的亞硝胺類雜質（NDSRI），使得監管機構和制藥企業對該類雜質一直高度關注。
NDSRI(Nitrosamine drug substance-related impurities)是一類與原料藥有著類似結構單元的亞硝胺類雜質，它可通過含仲胺或叔胺結構的原料藥(或原料藥片段)亞硝化形成。NDSRI雜質是每種原料藥特有的雜質，通常因缺乏致癌性和致突變性研究數據，確定其在藥品中的可接受水平極具挑戰。2023年8月4日，FDA發布了亞硝胺原料藥相關雜質推薦可接受攝入量（AI）限度值的控制指南，該指南根據預測的致癌效力分類為NDSRI雜質AI值提供了建議，同時相關的指南文件也一直在持續更新。
地氯雷他定（Desloratadine），又稱AERIUS (先靈葆雅)/DENOSIN (美時)，屬于三環長效型的第三代組織胺拮抗劑(Antagonist)，選擇性作用在H1接受體，其化學名為8-氯-6, 11-二氫-11-(4-亞哌啶基)-5H-苯并[5, 6]庚烷[1, 2b]吡啶，分子式為C19H19N2Cl。一般用于緩解慢性特發性蕁麻疹及常年過敏性鼻炎的全身及局部癥狀。地氯雷他定因結構中含有仲胺，可能會產生相應的NDSRI雜質，推測其亞硝基雜質結構如下圖1，根據FDA發布的亞硝胺原料藥相關雜質推薦可接受攝入量控制指南中記載N-亞硝基-地氯雷他定AI（允許攝入量，Acceptable Intake）值均為400ng/天。
圖1 地氯雷他定及其N-亞硝基-地氯雷他定結構圖
亞硝胺雜質AI值為400ng/天，結合地氯雷他定口服溶液已批準說明書規定的最大日劑量5mg/天計算，控制限度為80ppm。結合限度，開發了高效液相色譜法對地氯雷他定原料中的亞硝胺雜質進行測定，并且對方法采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3400系列配置紫外檢測器進行相應的方法學驗證，包括：專屬性、線性、準確度、重復性、檢測限等，結果顯示該方法專屬、靈敏。
關鍵詞：地氯雷他定、高效液相色譜法、NDSRI雜質。
1.儀器設備及試劑
1.1液相配置清單
表1 高效液相色譜系統配置清單
序號 | 名稱 | 數量 |
1 | LC3400系列高效液相色譜儀 | 1臺 |
2 | P3400B 二元高壓恒流泵 | 1臺 |
3 | CT3400 柱溫箱 | 1臺 |
4 | AS3400 全自動進樣器 | 1臺 |
5 | SmartLab NetCDS 色譜使用工作站 | 1套 |
6 | C18 250x4.6 mm，5 μm | 1個 |
1.2試劑及標準品清單
表2 試劑及標品清單表
序列 | 試劑及標準品 | 純度 |
1 | 乙腈 | HPLC級 |
2 | 三氟乙酸 | AR級 |
3 | 十二烷基硫酸鈉 | AR級 |
4 | N-亞硝基-地氯雷他定 | 98.9% |
1.3實驗材料及輔助設備
超聲波清洗機；
渦旋混合器。
2.實驗方法
2.1 溶液配制
2.1.1 十二烷基硫酸鈉水溶液:取0.865g十二烷基硫酸鈉，三氟乙酸0.5mL，加水稀釋至溶解在1000mL。
2.1.2 溶劑:同流動相（精密量取十二烷基硫酸鈉水溶液570mL和乙腈430mL，混勻，即得。
2.1.3 線性溶液:取N-亞硝基-地氯雷他定對照品各適量，精密稱定加流動相溶解并稀釋至每1mL約含0.8μg的溶液，作為標準貯備液母液；然后精密量取標準貯備液1.0mL、1.5mL、2.0mL、4.0mL、10.0mL分別置于5個100mL容量瓶中，加流動相定容至刻度線，搖勻，配制成濃度為8ng/mL、12ng/mL、16ng/mL、32ng/mL和80ng/mL標準系列工作曲線。
2.1.4 對照品溶液:取N-亞硝基-地氯雷他定對照品各適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋制成每1mL約含N-亞硝基-地氯雷他定16ng的溶液，作為對照品溶液。
2.2 樣品配制
2.2.1 樣品溶液
精密移取地氯雷他定原料滴劑適量，用流動相溶解并稀釋制成每1mL約含地氯雷他定0.2mg的溶液，作為樣品溶液。
2.2.2 準確度溶液
準確度樣品配制：取地氯雷他定原料約20mg，精密稱定至100mL量瓶中，加入適量的N-亞硝基-地氯雷他定對照品溶液，用流動相溶解并稀釋至刻度，配制成100%加標樣品，搖勻，即得，作為準確度溶液。
3.實驗結果
3.1 專屬性
圖2 專屬性測試譜圖
說明：溶劑不干擾N-亞硝基-地氯雷他定檢測，供試品溶液中其他雜質色譜峰亦不干擾N-亞硝基-地氯雷他定雜質測定。
3.2 線性測試
圖3 N-亞硝基-地氯雷他定雜質測試色譜疊加圖
圖4 N-亞硝基-地氯雷他定雜質標準曲線圖
說明：實驗結果顯示，N-亞硝基-地氯雷他定雜質測試曲線相關系數R值在0.999以上，滿足試驗要求。
3.3 重復性測試
圖5 6針16ng/mL標準品重復性測試譜圖
表3 6針16ng/mL標準品重復性測試數據
化合物名 | 保留時間（min） | 峰面積(mAU*s) |
N-亞硝基-地氯雷他定 | 15.426 | 2.917 |
15.432 | 2.864 | |
15.414 | 2.838 | |
15.416 | 2.994 | |
15.423 | 2.856 | |
15.417 | 2.937 | |
平均值 | 15.421 | 2.901 |
RSD（%） | 0.045 | 2.043 |
說明：由上表數據可知，N-亞硝基-地氯雷他定保留時間重復性為0.045%；峰面積重復性為2.043%，重復性良好。
3.4 準確度測試
圖6 地氯雷他定原料準確度疊加圖
表4 地氯雷他定原料準確度（N-亞硝基-地氯雷他定）
水平 | 已有量（ng） | 加入量（ng） | 測得量（ng） | 回收率（%） | 平均值（%） | RSD（%） |
100% | 0.00 | 1611.52 | 1656.365 | 99.690 | 100.11 | 2.58 |
100% | 0.00 | 1610.546 | 96.932 | |||
100% | 0.00 | 1686.721 | 101.517 | |||
100% | 0.00 | 1704.476 | 102.585 | |||
100% | 0.00 | 1615.701 | 97.242 | |||
100% | 0.00 | 1706.194 | 102.689 |
說明：6份樣品中N-亞硝基-地氯雷他定的回收率在97.24~102.69%，RSD為2.58%，本方法檢測準確度及重復性良好。
3.5 檢測限測試
圖7 N-亞硝基-地氯雷他定濃度為8ng/mL對照品測試譜圖
表5 N-亞硝基-地氯雷他定濃度為8ng/mL對照品測試數據
名稱 | 保留時間(min) | 峰面積(mAU*s) | 信噪比 |
N-亞硝基-地氯雷他定 | 15.434 | 1.213 | 30.042 |
說明：根據上表N-亞硝基-地氯雷他定濃度為8ng/mL對照品測測試數據，3倍信噪比為檢測限計算可知N-亞硝基-地氯雷他定檢測限理論結果分別為0.7989ng/mL。
3.6 某廠家原料測試
圖8 某廠家原料和口服溶液測試譜圖
說明：某品牌原料中未檢測出N-亞硝基-地氯雷他定。
4.結論
根據FDA日前發布的藥物基質亞硝胺雜質（NDSRI，Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities）允許攝入量設定的指南文件對地氯雷他定原料中亞硝胺雜質N-亞硝基-地氯雷他定進行研究。根據該文件計算AI（允許攝入量，Acceptable Intake）值均為400ng/天，同時結合本品最大日劑量（5mg），在原料中的控制限度均為不得過80ppm。采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3400系列配置紫外檢測器進行相應的方法學驗證,用已驗證的檢測方法對原料樣品進行檢測未檢出亞硝胺雜質N-亞硝基-地氯雷他定。以上數據均滿足藥典方法對于儀器的要求。
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