方案概述
前言：
亞硝胺雜質是指一類常見的有機化合物，其結構中含有一個或多個亞硝基（-NO）基團。 亞硝胺雜質通常在食品、飲料、藥品以及化妝品等產品中存在。它們是由于食品加工過程中，其中含有的亞硝酸鹽與氨基化合物（如氨基酸和蛋白質）反應生成的。亞硝胺雜質被認為具有潛在的致癌和致突變作用，因此對其進行監測和控制至關重要。根據亞硝胺結構可以將亞硝胺分為兩類，一類是小分子亞硝胺如NDMA、NDEA等，另外一類是NDSRIs（藥物成分相關亞硝胺），其與API結構相似或相關，由API或其片段中的胺基與物料中亞硝化試劑（如亞硝酸鹽）反應生成。
利福平與利福噴丁均為治療結核最常見的藥物之一，其利福平合成路徑中產生的與API片段相似的1-甲基-4-亞硝基哌嗪（MNP）與利福噴丁合成路徑中產生的1-環戊基-4-亞硝基哌嗪均為亞硝胺雜質。
本方法通過皖儀科技LC-MS TQ9200三重四極桿液質聯用系統檢測利福平與利福噴丁中MNP與CPNP，其中，MNP與CPNP線性范圍均大于0-100 ng/mL，0.1 ng/mL信噪比均大于10，滿足實驗要求，完全適用于高效快速準確地檢測利福平與利福噴丁中的MNP與CPNP含量。
關鍵詞：液質聯用；亞硝胺雜質；利福平、利福噴丁。
1.儀器配置
表1 儀器配置清單
儀器 | 數量 |
皖儀LC3600系列高效液相色譜 | 1 |
皖儀TQ9200系列三重四極桿質譜儀 | 1 |
渦旋混勻器 | 1 |
離心機 | 1 |
2.儀器方法
2.1 液相條件
色譜柱：phenomenex Kinetex F5 2.6 μm，3x100 mm
流動相：A相：甲醇
B相：水
流速：0.3 mL/min
柱溫：40 ℃
進樣體積：5 μL
2.2 質譜條件
本方法使用電噴霧離子源，離子源電壓為5500 V，脫溶劑氣流量為17000 mL/min，脫溶劑氣溫度為450 ℃，霧化氣流量為2000 mL/min，氣簾氣流量為8000 mL/min，氣簾氣溫度為150 ℃，碰撞氣流量為800 μL/min。
2.3 化合物參數
表2 質譜化合物參數
化合物名稱 | 掃描模式 | 前體離子 | 產物離子 | DP（V） | CE（eV） | CXP（V） |
MNP | + | 130.2 | 100.2 | 48 | 12 | 11 |
58.1* | 48 | 22 | 11 | |||
CPNP | + | 184.3 | 154.3 | 30 | 12 | 11 |
98.3* | 30 | 18 | 11 |
注：帶*為定量離子
3.方法學驗證
3.1 實驗結果
9.5分鐘內完成利福平與利福噴丁中MNP與CPNP的測定，化合物均有良好的峰形，無常見的峰形拖尾現象，化合物響應良好，符合實驗測定需求。
圖1 實驗結果總圖
3.2 標準曲線
精確配制100 μg/mL MNP與CPNP混標，稀釋至0.2μg/mL，逐級稀釋為200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL。
表2 標準曲線及線性范圍
化合物 | 線性方程 | R2 | 線性范圍( ng/mL) |
MNP | Y=125306.43*X+730.35 | 0.999 82 | 0-200 |
CPNP | Y=559701.56*X-13894.98 | 0.999 50 | 0-100 |
圖2 MNP標準曲線 圖3 CPNP標準曲線
3.3 精密度
連續進樣6針0.5 ng/mL、5 ng/mL、50 ng/mL分別檢測該線性在低中高不同濃度的重復性，RSD小于3%，符合要求。
表2 精密度數據結果
濃度( ng/mL) | MNP | CPNP |
RSD(%,n=6) | RSD(%,n=6) | |
0.5 | 2.364 | 2.423 |
5 | 2.893 | 1.425 |
50 | 2.904 | 0.932 |
圖4 MNP 6針重復性色譜圖 圖5 CPNP 6針重復性色譜圖
3.4 靈敏度
使用峰到峰方式計算0.1 ng/mL MNP信噪比為19.674，0.1 ng/mL CPNP信噪比為47.964，均大于10，符合要求。
表5 靈敏度數據結果
化合物 | 0.1 ng/mL信噪比 |
MNP | 19.674 |
CPNP | 47.964 |
圖6 0.1 ng/mL色譜圖
3.5 樣品檢測
取利福平與利福噴丁膠囊內容物配置成樣品溶液，稀釋后進液質聯用系統分析，實驗結果如下：
表6 樣品含量檢測結果
化合物 | 樣品量( ng/mL) | RSD(%,n=3) |
MNP | 0.052 | 6.480 |
CPNP | 0.137 | 2.120 |
圖7 利福平中的MNP色譜圖
圖8 利福噴丁中的CPNP色譜圖
在FDA公布的含有亞硝胺雜質的藥物中，MNP與CPNP限值均為400 ng/day，其成人每日最大攝入量為300 mg。將利福平和利福噴丁處理完成的上清液進液質檢測以后發現利福平溶出液中含有MNP含量為0.052 ng/mL；利福噴丁溶出液中CPNP含量為0.137 ng/mL，而假設每天攝入300 mg藥物，則MNP攝入量為15.6 ng/day，CPNP攝入量為41.1 ng/day，均小于FDA規定的限值。
4.結論
經過以上內容的驗證，說明本方法適用于檢測利福平與利福噴丁中的MNP與CPNP，其中，MNP與CPNP線性范圍均大于0-100 ng/mL，0.1 ng/mL信噪比均大于10，滿足實驗要求，完全適用于高效快速準確地檢測利福平與利福噴丁中的MNP與CPNP含量。
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