安徽省首家科創(chuàng)板上市企業(yè) 股票代碼： 688600

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皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)測(cè)定雞肉中硝基呋喃類代謝物殘留

方案概述

前言：

硝基呋喃類抗生素曾以其卓越的廣譜抗菌活性和相對(duì)低廉的成本，被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，作為促生長(zhǎng)添加劑和治療多種動(dòng)物細(xì)菌性及原蟲性感染疾病（如腸道感染、球蟲病）的重要藥物。其核心作用機(jī)制在于其代謝產(chǎn)生的活性衍生物能不可逆地抑制細(xì)菌乙酰輔酶A等多種酶系統(tǒng)，強(qiáng)力干擾微生物的糖代謝過(guò)程，最終導(dǎo)致病原體死亡。然而，由于硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物被證實(shí)具有潛在的“三致”作用（致癌、致畸、致突變）以及遺傳毒性，對(duì)消費(fèi)者健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，并可能引發(fā)過(guò)敏反應(yīng),已全面禁止其在食用動(dòng)物生產(chǎn)中的任何用途。硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，原形藥物在可食用組織中難以檢出，但其代謝產(chǎn)物卻能與組織大分子（如蛋白質(zhì)）形成穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合物（鍵合殘留），從而長(zhǎng)期蓄積于動(dòng)物肌肉、肝臟、腎臟及蛋、奶等可食性產(chǎn)品中。因此直接檢測(cè)這四種關(guān)鍵代謝物成為監(jiān)控硝基呋喃類藥物非法使用、評(píng)估食品中該類殘留風(fēng)險(xiǎn)的核心手段和唯一有效途徑。建立高靈敏、高選擇性的硝基呋喃代謝物檢測(cè)技術(shù)對(duì)于保障食品安全、維護(hù)消費(fèi)者健康權(quán)益、確保動(dòng)物源性產(chǎn)品順利出口以及有效打擊非法用藥行為具有至關(guān)重要的意義。

我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 31650-2019食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定硝基呋喃類抗生素作為食品中禁止檢出藥物；同時(shí)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 21311-2007 動(dòng)物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測(cè)方法高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定了4種硝基呋喃類代謝物液質(zhì)檢測(cè)方法。本應(yīng)用方案成功驗(yàn)證了皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)滿足雞肉中4種硝基呋喃類代謝物殘留的檢測(cè)方法要求。

關(guān)鍵詞：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；硝基呋喃類代謝物；食品安全；獸藥殘留

1.儀器設(shè)備及試劑

1.1液相串聯(lián)質(zhì)譜配置清單

表1 儀器配置清單表

序號(hào)	名稱	數(shù)量
1	LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)	1臺(tái)
2	P3600B 二元高壓恒流泵	1臺(tái)
3	CT3600 柱溫箱	1臺(tái)
4	AS3600 超高效自動(dòng)進(jìn)樣器	1臺(tái)
5	SmartLab CDS 2.0色譜使用工作站	1套

1.2試劑及標(biāo)準(zhǔn)品清單

表2 試劑及標(biāo)品清單表

序列	試劑及標(biāo)準(zhǔn)品	純度
1	甲醇	LC-MS級(jí)
2	乙腈	LC-MS級(jí)
3	甲酸	LC-MS級(jí)
4	鹽酸	分析純
5	乙酸乙酯	分析純
6	乙酸銨	分析純
7	2-硝基苯甲醛	分析純
8	磷酸氫二鉀	分析純
9	二甲亞砜	分析純
10	氟苯尼考胺	99%
11	3-氨基-2-惡唑酮（AOZ）	99%
12	AOZ-D₄	99%
13	5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ）	99%
14	AMOZ-D₅	99%
15	1-氨基-乙內(nèi)酰脲（AHD）	99%
16	AHD-¹³C₃	99%
17	氨基脲（SEM）	99%
18	SEM-¹³C,¹⁵N₂	99%

1.3實(shí)驗(yàn)材料及輔助設(shè)備

超聲波清洗機(jī)；

渦旋混合器；

水浴氮吹儀；

水浴恒溫振蕩器；

高速離心機(jī)。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1溶液配制

2.1.1 0.2 mol/L 鹽酸溶液：取鹽酸1.7 mL，加水稀釋到100 mL。

2.1.2 2 mol/L 氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉80 g，用水溶解并稀釋到1000 mL，混勻。

2.1.3 0.1 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液：取2-硝基苯甲醛 1.5 g，用甲醇溶解并稀釋至100 mL，混勻。

2.1.4 0.3 mol/L 磷酸鉀溶液：取三水磷酸鉀39.95 g，用水溶解并稀釋至500 mL，混勻。

2.1.5 乙腈飽和正己烷溶液：取適量的正己烷，加入過(guò)量的正己烷溶液，充分震蕩分層，取上層正己烷溶液。

2.2樣本前處理

2.2.1樣本水解與衍生

稱取試料2g(準(zhǔn)確至±0.01g)，于50 mL聚丙烯離心管中，加10 mL 50%甲醇水溶液，渦旋振蕩10 min，4000 rpm 離心10 min，棄去上清液。準(zhǔn)確加混合內(nèi)標(biāo)工作液100 µL，渦旋1 min，加鹽酸溶液10 mL、2-硝基苯甲醛溶液100 µL，渦旋混合1 min，置于水浴恒溫振蕩器中，37℃避光振蕩16 h。

2.2.2樣本凈化

取出離心管冷卻至室溫，加入2 mL0.3mol/L磷酸鉀溶液，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.4，加乙酸乙酯15 mL，渦旋振蕩1 min，6000 rpm 離心5 min，收集乙酸乙酯層至15 mL聚丙烯離心管中，40℃氮?dú)獯蹈伞＜?.1%甲酸水溶液1 mL溶解殘留物，再用3 mL乙腈飽和正己烷除脂，下層水相過(guò)0.22 µm有機(jī)濾膜，待進(jìn)樣。

2.2.3基質(zhì)標(biāo)線配制

稱取5份陰性試料2g(準(zhǔn)確至±0.01g)，于50 mL聚丙烯離心管中，加10 mL 50%甲醇水溶液，渦旋振蕩10 min，4000 rpm 離心10 min，棄去上清液。殘留物中準(zhǔn)確加入適量標(biāo)準(zhǔn)品，最終配制濃度分別為0.5、1、2、5、10、20ng/mL，余下步驟如上述樣本處理方法相同。

2.3實(shí)驗(yàn)條件

2.3.1液相方法條件

色譜柱：C18 1.7μm 2.1x50mm

流動(dòng)相：A相：甲醇；B相：2 mM乙酸銨水

流速：0.3 mL/min

柱溫：35 ℃

進(jìn)樣體積：5 µL

2.3.2質(zhì)譜方法條件

表3 質(zhì)譜離子源參數(shù)

離子源	參數(shù)
離子源電壓	ESI+5000 V
脫溶劑氣流速	15000 mL/min
霧化氣流速	2000 mL/min
氣簾氣流速	5000 mL/min
碰撞氣流速	800 μL/min
脫溶劑氣溫度	500 ℃
氣簾氣溫度	150 ℃

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1標(biāo)準(zhǔn)品譜圖

7分鐘內(nèi)完成4種硝基呋喃類抗生素代謝物及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，各峰均有良好的峰形，無(wú)峰形拖尾現(xiàn)象，各化合物響應(yīng)良好，符合實(shí)驗(yàn)測(cè)定需求。

圖1 4種硝基呋喃類抗生素代謝物及內(nèi)標(biāo)色譜圖（0.5 ng/mL）

3.2線性范圍

取適量硝基呋喃類代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品水解、衍生、凈化步驟前處理制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，線性范圍為0.5-20 ng/mL，線性檢測(cè)結(jié)果與已知濃度的偏差小于最大允許偏差，R²范圍在0.9984~0.9999之間，均大于0.99，各組分線性關(guān)系良好。

表4各化合物線性范圍表

化合物	線性范圍	回歸方程	線性相關(guān)系數(shù)R²
AOZ	0.5-20 ng/mL	Y=0.250X+0.001	0.9984
AMOZ	0.5-20 ng/mL	Y=0.255X+0.030	0.9999
AHD	0.5-20 ng/mL	Y=0.238X-0.010	0.9996
SEM	0.5-20 ng/mL	Y=0.255X+0.014	0.9998

圖2 4種化合物線性結(jié)果

3.3檢測(cè)限與定量限

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21311-2007中規(guī)定本方法中4種硝基呋喃類代謝物的檢測(cè)限為0.5 µg/kg，定量限為1 µg/kg。本方法中各化合物在檢測(cè)限與定量限規(guī)定濃度下信噪比大于3和10，符合國(guó)標(biāo)中靈敏度要求。

表5 各化合物檢測(cè)限與定量限

化合物	信噪比（S/N）
化合物	檢測(cè)限	定量限
AOZ	54.99	126.00
AMOZ	31.35	101.98
AHD	47.08	109.69
SEM	12.00	40.82

圖3 4種化合物檢測(cè)限與定量限色譜圖

3.4精密度測(cè)試

取低中高三種濃度硝基呋喃類代謝物混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針比較保留時(shí)間與峰面積偏差，結(jié)果如下表所示，所有硝基呋喃類代謝物保留時(shí)間偏差均小于1%，峰面積偏差均小于5%，符合國(guó)標(biāo)的RSD≤15%的精密度要求。

表6 各化合物精密度測(cè)試

化合物	濃度(ng/mL)	保留時(shí)間偏差RSD(%，n=6)	峰面積偏差 RSD(%，n=6)
AHD	1	0.24	4.78
	2	0.44	3.46
	5	0.39	2.45
AOZ	1	0.19	2.42
	2	0.36	3.04
	5	0.55	2.50
SEM	1	0.20	2.58
	2	0.44	3.65
	5	0.46	2.66
AMOZ	1	0.14	2.91
	2	0.49	2.03
	5	0.46	2.63

圖4 4種硝基呋喃類代謝物精密度色譜圖

3.5基質(zhì)加標(biāo)回收率測(cè)試

采用加標(biāo)回收試驗(yàn)評(píng)估該檢測(cè)項(xiàng)目的正確度：測(cè)定各檢測(cè)指標(biāo)的濃度，將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品按不同比例加到空白基質(zhì)樣品中進(jìn)行前處理，制作高、中、低三個(gè)不同濃度的基質(zhì)加標(biāo)樣品。每個(gè)濃度的加標(biāo)樣品獨(dú)立測(cè)定6次，通過(guò)檢測(cè)加標(biāo)前后基質(zhì)中的濃度，計(jì)算回收率，評(píng)估該項(xiàng)目的準(zhǔn)確度。結(jié)果如下所示：雞肉基質(zhì)中各化合物加標(biāo)回收率在88.32-105.05%之間，CV在5%以內(nèi)，準(zhǔn)確度符合方法要求。

表7 雞肉基質(zhì)中各化合物加標(biāo)回收率

化合物	加標(biāo)量(ng/mL)	測(cè)得量（ng/mL）	平均回收率（%，n=6）	CV（%，n=6）
AHD	2.00	1.98	99.13	2.52
	4.00	4.20	105.05	2.50
	10.00	10.39	103.92	3.38
AOZ	2.00	1.77	88.32	3.72
	4.00	3.70	92.57	4.32
	10.00	9.59	95.86	2.59
SEM	2.00	1.98	98.96	3.95
	4.00	4.08	102.06	4.42
	10.00	10.47	104.68	0.89
AMOZ	2.00	1.87	93.48	2.91
	4.00	4.06	101.45	1.27
	10.00	10.40	104.00	1.04

3.6樣品測(cè)試

公司附近超市隨機(jī)購(gòu)買雞胸肉樣品，經(jīng)上述樣品前處理方法提取、凈化，樣品上機(jī)測(cè)試，4種硝基呋喃類代謝物對(duì)應(yīng)保留時(shí)間均無(wú)色譜峰測(cè)出，其他色譜峰為衍生化后雜質(zhì)，結(jié)果表明雞胸肉樣品4種硝基呋喃類代謝物均未檢出。

圖5 超市雞胸肉樣品中4種硝基呋喃類代謝物化合物色譜圖

4結(jié)論

本方法使用皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，進(jìn)行動(dòng)物源食品中硝基呋喃類代謝物含量的測(cè)定。由數(shù)據(jù)可得該方法的各色譜峰峰形良好、無(wú)拖尾，靈敏度符合國(guó)標(biāo)要求，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，連續(xù)6針各化合物保留時(shí)間偏差在1%以內(nèi)，峰面積偏差均在5%以內(nèi)，精密度良好；雞肉基質(zhì)加標(biāo)回收率在88.3-105.1% 之間，CV在5%以內(nèi)；超市隨機(jī)購(gòu)買雞胸肉樣品，上機(jī)測(cè)試4種硝基呋喃類代謝物均未檢出。說(shuō)明了該方法配備皖儀科技液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)滿足對(duì)待測(cè)樣本的常規(guī)性定性定量檢測(cè)需求。