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方案概述

前言：

酰胺醇類抗生素（Chloramphenicols，CAPs）是一類具有廣譜抗菌活性的藥物，代表性藥物包括氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考。其核心藥理作用在于不可逆結合細菌核糖體50S亞基的肽酰轉移酶中心，阻斷肽鏈延伸，從而高效抑制細菌蛋白質合成（作用機制）。該特性使其對革蘭氏陰性菌（如沙門氏菌、大腸桿菌）及部分陽性菌（如鏈球菌）均表現出顯著抑菌活性。在獸藥使用方面，因成本低廉、組織穿透力強（尤其對血腦屏障和血眼屏障），酰胺醇類廣泛用于畜牧業，治療豬、牛以及禽類的呼吸道疾病（如豬胸膜肺炎、牛巴氏桿菌病）、消化道感染及神經系統感染。然而，因其超范圍與超劑量用藥、忽視休藥期、代謝復雜性以及交叉污染等因素，獸藥殘留問題日益嚴峻。殘留導致的健康危害具有遺傳毒性、肝腎損傷、耐藥性危機以及母嬰風險等多維風險，因此對動物源性食品中酰胺醇類抗生素藥物殘留的檢測已成為獸藥研發以及食品安全控制中必不可少的重要環節。

我國食品安全國家標準《GB 31650-2019食品中獸藥最大殘留限量》中規定部分酰胺醇類抗生素動物源食品中的獸藥最大殘留量，其中氯霉素作為食品中禁止檢出藥物；同時食品安全國家標準《GB 31658.20-2022 食品安全國家標準動物性食品中酰胺醇類藥物及其代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》中規定了4種酰胺醇類液質檢測方法。本應用方案成功驗證了皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯質譜系統滿足雞肉中4種酰胺醇類抗生素殘留的檢測方法要求。

關鍵詞：液相色譜串聯質譜；酰胺醇；食品安全；獸藥殘留

1.儀器設備及試劑

1.1液相串聯質譜配置清單

表1 儀器配置清單表

序號	名稱	數量
1	LCMS-TQ9200液相色譜串聯質譜系統	1臺
2	P3600B 二元高壓恒流泵	1臺
3	CT3600 柱溫箱	1臺
4	AS3600 超高效自動進樣器	1臺
5	SmartLab CDS 2.0色譜使用工作站	1套

1.2試劑及標準品清單

表2 試劑及標品清單表

序列	試劑及標準品	純度
1	甲醇	LC-MS級
2	乙腈	LC-MS級
3	甲酸	LC-MS級
4	氨水	分析純
5	乙酸乙酯	分析純
6	正己烷	分析純
7	氯化鈉	分析純
8	氟苯尼考胺	99%
9	氟苯尼考胺-D3	99%
10	氯霉素	99%
11	氯霉素-D5	99%
12	甲砜霉素	99%
13	甲砜霉素-D3	99%
14	氟苯尼考	99%
15	氟苯尼考-D3	99%

1.3實驗材料及輔助設備

超聲波清洗機；

渦旋混合器；

水浴氮吹儀；

高速離心機。

2.實驗方法

2.1溶液配制

2.1.1 2%氨化乙酸乙酯溶液：取氨水4 mL，用乙酸乙酯稀釋到200 mL。

2.1.2 4%氯化鈉溶液：取氯化鈉4 g，用水溶解并稀釋到100 mL。

2.1.3 4%氯化鈉飽和的正己烷溶液：取適量的4%氯化鈉溶液，加入過量的正己烷，混合，靜置分層，取上層正己烷。

2.1.4 混合內標工作液：取適量的混合內標母液，20%甲醇稀釋到氯霉素-D5 10 ng/mL，其他內標（氟苯尼考-D3、甲砜霉素-D3和氟苯尼考胺-D3）為50 ng/mL。

2.2樣本前處理

2.2.1樣本提取

稱取樣品2 g(準確至±0.01g)，加混合內標工作液100 µL，渦旋1 min，渦旋混勻，加2%氨化乙酸乙酯溶液10 mL，渦旋震蕩10 min，8000 rpm離心5 min，取上清液，殘渣加2%氨化乙酸乙酯溶液10 mL，重復上述步驟提取一遍。合并兩次上清液，于50℃氮氣吹干，備用。

2.2.2樣本凈化

取凈化殘渣加4%氯化鈉溶液3 mL渦旋使其溶解，再加4%氯化鈉飽和的正己烷溶液5 mL，渦旋30 s，8000 rpm離心5 min，棄去上層正己烷層，再重復脫脂一次。加2%氨化乙酸乙酯溶液5 mL，渦旋震蕩10 min，8000 rpm離心5 min，取上清液，殘渣加2%氨化乙酸乙酯溶液5 mL，重復上述步驟提取一遍。合并上清液，于50℃氮氣吹干，加20%甲醇溶液1 mL渦旋30s，過濾膜，待上機。

2.3實驗條件

2.3.1液相方法條件

色譜柱：C18 1.7μm 2.1x50mm

流動相：A相：乙腈；B相：2 mM甲酸銨水

流速：0.3 mL/min

柱溫：40 ℃

進樣體積：5 µL

2.3.2質譜方法條件

表3 質譜離子源參數

離子源	參數
離子源電壓	ESI+5000 V/ -4000 V
脫溶劑氣流速	15000 mL/min
霧化氣流速	2000 mL/min
氣簾氣流速	5000 mL/min
碰撞氣流速	800 μL/min
脫溶劑氣溫度	500 ℃
氣簾氣溫度	150 ℃

3實驗結果

3.1標準品譜圖

6分鐘內完成4種酰胺醇抗生素及內標的測定，各峰均有良好的峰形，無峰形拖尾現象，各化合物響應良好，符合實驗測定需求。

圖1 4種酰胺醇類抗生素及內標色譜圖

（氯霉素 0.2 ng/mL,其他抗生素1 ng/mL）

3.2線性范圍

取適量酰胺醇類混合標準溶液，逐級稀釋到系列濃度制作標準曲線，線性范圍氯霉素0.2-10 ng/mL，氟苯尼考胺、甲砜霉素和氟苯尼考1-50 ng/mL，線性檢測結果與已知濃度的偏差小于最大允許偏差，R²范圍在0.9958~0.9998之間，各組分線性關系良好。

表4各化合物線性范圍表

化合物	線性范圍	回歸方程	線性相關系數R²
氟苯尼考胺	1-50 ng/mL	Y=0.215X-0.005	0.9998
氯霉素	0.2-10 ng/mL	Y=3.476X+0.112	0.9994
甲砜霉素	1-50 ng/mL	Y=1.150X-0.055	0.9958
氟苯尼考	1-50 ng/mL	Y=0.2658X+0.2175	0.9978

圖2 4種化合物線性結果

3.3檢測限與定量限

食品安全國家標準GB 31658.20-2022中規定本方法氯霉素的檢測限為0.1µg/kg，定量限為0.2 µg/kg；甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的檢測限為0.5 µg/kg，定量限為1 µg/kg。本方法中各化合物在檢測限與定量限規定濃度下信噪比遠大于3和10，符合國標中靈敏度要求。

表5 各化合物檢測限與定量限

化合物	信噪比（S/N）
化合物	檢測限	定量限
氟苯尼考胺	33.30	71.43
氯霉素	66.91	185.57
甲砜霉素	74.32	257.56
氟苯尼考	136.55	386.17

圖3 4種化合物檢測限與定量限色譜圖

3.4精密度測試

取低中高三種濃度酰胺醇類標準物質混合溶液，連續進樣6針比較保留時間與峰面積偏差，結果如下表所示，所有酰胺醇類化合物保留時間偏差均小于1%，峰面積偏差均小于5%，符合國標的RSD≤15%的精密度要求。

表6 各化合物精密度測試

化合物	濃度(ng/mL)	保留時間偏差RSD(%，n=6)	峰面積偏差 RSD(%，n=6)
氟苯尼考胺	2	0.65	1.72
	5	0.75	1.40
	10	0.65	1.08
甲砜霉素	2	0.20	3.31
	5	0.25	4.84
	10	0.31	4.39
氟苯尼考	2	0.29	4.01
	5	0.29	4.26
	10	0.18	4.39
氯霉素	0.4	0.28	3.18
	1	0.18	2.51
	2	0.25	2.48

圖4 4種酰胺醇類化合物精密度色譜圖

3.5基質加標回收率測試

采用加標回收試驗評估該檢測項目的正確度：測定各檢測指標的濃度，將已知濃度的標準品按不同比例加到空白基質樣品中進行前處理，制作高、中、低三個不同濃度的基質加標樣品。每個濃度的加標樣品獨立測定6次，通過檢測加標前后基質中的濃度，計算回收率，評估該項目的準確度。結果如下所示：雞肉基質中各化合物加標回收率在94.5-107.2%之間，CV在5%以內，準確度符合方法要求。

表6 雞肉基質中各化合物加標回收率

化合物	加標量(ng/mL)	測得量（ng/mL）	平均回收率（%，n=6）	CV（%，n=6）
氟苯尼考胺	2	2.04	101.80	3.92
	5	4.99	99.83	1.20
	10	9.45	94.48	3.41
甲砜霉素	2	2.01	100.54	4.05
	5	5.16	103.15	2.53
	10	9.76	97.60	4.44
氟苯尼考	2	2.02	100.96	2.84
	5	5.25	105.00	2.47
	10	10.72	107.23	1.82
氯霉素	0.4	0.41	102.00	2.85
	1	1.02	101.82	3.96
	2	2.09	104.28	4.54

3.6樣品測試

公司附近超市隨機購買雞胸肉樣品，經上述樣品前處理方法提取、凈化，樣品上機測試，4種酰胺醇類抗生素均未檢出。

圖5 超市雞胸肉樣品中4種酰胺醇類化合物色譜圖

4結論

本方法使用皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯質譜系統，進行動物源食品中酰胺醇類抗生素的測定，正負離子模式化合物可同時采集。由數據可得該方法的各色譜峰峰形良好、無拖尾，靈敏度符合國標要求，線性相關系數均大于0.99，連續6針各化合物保留時間偏差在1%以內，峰面積偏差均在5%以內，精密度良好；雞肉基質加標回收率在94.5-107.2%之間，CV在5%以內，準確度符合方法要求；超市隨機購買雞胸肉樣品，上機測試4種酰胺醇類抗生素均未檢出。說明了該方法配備皖儀科技液相色譜串聯質譜系統滿足對待測樣本的常規性定性定量檢測需求。