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皖儀 LCMS-TQ9200 液質聯用系統測定4種β受體拮抗劑藥物中亞硝胺類雜質的應用方案

方案概述

前言：

FDA發布了關于亞硝胺原料藥相關雜質（NDSRI）推薦可接受攝入量限度值的最終指南（后稱指南），該指南根據預測的致癌效力分類為NDSRI 雜質的AI限值提供了建議。2024年9月4日，FDA發布了關于人用藥物中亞硝胺雜質控制的最新指南（《人用藥中亞硝胺雜質控制》第二版本）。亞硝胺指南描述了兩類亞硝胺——小分子亞硝胺和NDSRI。

鹽酸普萘洛爾片等4種β受體拮抗劑藥物主要用藥方向為控制高血壓、心絞痛、心肌梗死等情況，為高血壓患者常備藥品，其每日最大攝入量約為300mg/Day，而N-亞硝基普萘洛爾等四種雜質均是藥物合成路線中的產生的雜質，在最新指南中其限量均為1500ng/Day。

本應?方案成功驗證皖儀科技LCMS-TQ9200三重四極桿液質聯用系統分析4種β受體拮抗劑藥物中的亞硝胺類雜質的結果。

關鍵詞：三重四極桿液質聯用系統；亞硝胺雜質

1.儀器設備及試劑

1.1液相串聯質譜配置清單

表1 儀器配置清單表

序號	名稱	數量
1	LCMS-TQ9200液相色譜串聯質譜系統	1臺
2	P3600B 二元高壓恒流泵	1臺
3	CT3600 柱溫箱	1臺
4	AS3600 超高效自動進樣器	1臺
5	SmartLab CDS 2.0色譜使用工作站	1套
6	C18 1.7 μm 2.1x100 mm	1個

1.2試劑及標準品清單

表2 試劑及標品清單表

序列	試劑及標準品	純度
1	甲醇	LC-MS級
2	甲酸	LC-MS級
3	N-亞硝基普萘洛爾	20mg
4	N-亞硝基美托洛爾	20mg
5	N-亞硝基艾司洛爾	20mg
6	N-亞硝基比索洛爾	20mg
7	鹽酸普萘洛爾片	100mg*100片
8	酒石酸美托洛爾片	50mg*20片
9	鹽酸艾司洛爾	1g
10	富馬酸比索洛爾片	5mg*10片

1.3實驗材料及輔助設備

超聲波清洗機；

渦旋混合器；

高速離心機

2.實驗方法

2.1溶液配制

2.1.1 溶劑：0.2%甲酸溶液與甲醇的混合溶液（體積比40∶60），

2.1.2 雜質對照品貯備液：

取N-亞硝基普萘洛爾、N-亞硝基美托洛爾、N-亞硝基艾司洛爾和N-亞硝基比索洛爾對照品各約20 mg，精密稱定，分別置于10 mL容量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，混勻，即得對照品貯備液。

2.1.3 鹽酸普萘洛爾片供試品溶液：

取鹽酸普萘洛爾片，研細，取細粉適量（約相當于主成分50 mg），精密稱定，置15 mL離心管中，精密加入溶劑10 mL，于3 000 r/min條件下渦旋5 min后再超聲10 min，以10 000 r/min離心10 min，上清液經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 酒石酸美托洛爾片供試品溶液：

取酒石酸美托洛爾片，研細，取細粉適量（約相當于主成分100 mg），精密稱定，置15 mL離心管中，精密加入溶劑5 mL，于3 000 r/min條件下渦旋5 min后再超聲10 min，以10 000 r/min離心10 min，上清液經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.5 鹽酸艾司洛爾注射液供試品溶液：

取鹽酸艾司洛爾注射液，精密量取1 mL（約相當于主成分0.1 g）至10 mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.6富馬酸比索洛爾片供試品溶液：

取富馬酸比索洛爾片，研細，取細粉適量（約相當于主成分20 mg），精密稱定，置15 mL離心管中，精密加入溶劑2 mL，于3 000 r/min條件下渦旋5 min后再超聲10 min，以10 000 r/min離心10 min，上清液經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3實驗條件

2.3.1液相方法條件

色譜柱：C18, 1.7 µm 2.1x100mm

流動相：A相：甲醇；B相：0.2%甲酸水

流速：0.2 mL/min

柱溫：40 ℃

進樣體積：5 µL

2.3.2質譜方法條件

表3 質譜離子源參數

離子源	參數
離子源電壓	ESI+5500V
脫溶劑氣流速	17000mL/min
霧化氣流速	2000mL/min
氣簾氣流速	5000mL/min
碰撞氣流速	800μL/min
脫溶劑氣溫度	450℃
氣簾氣溫度	150℃

3實驗結果

3.1標準品譜圖

12分鐘內完成4種亞硝胺類雜質的測定，各峰均有良好的峰形，無峰形拖尾現象，各化合物響應良好，符合實驗測定需求。

圖1 4種亞硝胺類雜質色譜圖（10ng/mL）

3.2線性范圍

取亞硝胺類雜質標準物質混合溶液，逐級稀釋到系列濃度制作標準曲線，線性范圍0.1~20 ng/mL，線性檢測結果與已知濃度的偏差小于最大允許偏差，R²均大于0.995，各組分線性關系良好。

表5各化合物線性范圍表

化合物	線性范圍	線性相關系數R²
N-亞硝基普萘洛爾	0.1~20 ng/mL	0.999 90
N-亞硝基美托洛爾	0.1~20 ng/mL	0.996 84
N-亞硝基艾司洛爾	0.1~20 ng/mL	0.999 28
N-亞硝基比索洛爾	0.1~20 ng/mL	0.999 33

圖2 化合物線性結果

3.3檢測限與定量限

本方法中各化合物在0.05 ng/mL和0.1 ng/mL信噪比遠大于3和10，符合靈敏度要求。

表6 各化合物檢出限與定量限信噪比

化合物	信噪比（S/N）
化合物	0.05 ng/mL	0.1 ng/mL
N-亞硝基普萘洛爾	22.417	36.185
N-亞硝基美托洛爾	18.956	35.588
N-亞硝基艾司洛爾	47.236	162.216
N-亞硝基比索洛爾	22.788	57.717

圖3 化合物檢出限色譜圖

3.4精密度

取0.2、2、20ng/mL三種濃度亞硝胺類雜質標準物質混合溶液，連續進樣6針比較精密度；結果如下表所示，所有亞硝胺類雜質化合物均在4%以內，符合≤15%的精密度要求。

表7 各化合物精密度

化合物	濃度(ng/mL)	偏差RSD
N-亞硝基普萘洛爾	0.2	3.045%
	2	1.227%
	20	2.689%
N-亞硝基美托洛爾	0.2	1.729%
	2	2.534%
	20	1.420%
N-亞硝基艾司洛爾	0.2	2.189%
	2	2.287%
	20	0.930%
N-亞硝基比索洛爾	0.2	3.847%
	2	3.861%
	20	2.276%

圖4 化合物精密度色譜圖

3.5回收率

取100ng/mL亞硝胺類雜質標準物質混合溶液，以4種藥品供試品混合溶液稀釋至10ng/mL連續進樣6針比較回收率；結果如下表所示，所有亞硝胺類雜質化合物回收率均在85%-105%以內，符合80%-120%的回收率要求。

表8 各化合物回收率

化合物	加標濃度(ng/mL)	偏差RSD	回收率%
N-亞硝基普萘洛爾	10	2.343%	100.15%
N-亞硝基美托洛爾	10	3.242%	94.66%
N-亞硝基艾司洛爾	10	3.100%	88.86%
N-亞硝基比索洛爾	10	3.765%	88.11%

3.6空白殘留

取100ng/mL亞硝胺類雜質標準物質混合溶液，進樣后不做另外洗針操作，以后一針空白溶劑進樣檢測該方法空白殘留量，結果如下圖所示，發現目標物無殘留，符合小于定量下限濃度20%的空白殘留量要求。

圖5 化合物空白殘留量色譜圖

4結論

本方法使用皖儀科技LCMS-TQ9200液相質譜聯用系統，進行4種β受體拮抗劑藥物中的亞硝胺類雜質的測定。由數據可得該方法的各色譜峰峰形良好、無拖尾，靈敏度符合要求，線性相關系數均大于0.995，精密度均在4%以內，加標回收率在85-105%之間，高濃度樣本系統無殘留，說明了該方法配備皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜質譜聯用系統滿足對待測樣本的常規性定性定量檢測需求。