方案概述
前言：
亞硝胺雜質(zhì)是一類具有亞硝基與胺結(jié)合（R1N(-R2)-N=O）的化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，具有高潛在致突變致癌性。自華海纈沙坦事件以來，多種藥品中相繼檢出小分子亞硝胺類雜質(zhì)（如NDMA、NDEA、NDBA等）或與原料藥相關(guān)的亞硝胺類雜質(zhì)，使得監(jiān)管機構(gòu)和制藥企業(yè)對該類雜質(zhì)一直高度關(guān)注。富馬酸比索洛爾片的主要成份為富馬酸比索洛爾，其化學(xué)名稱為：1-[4-[[2-（1-甲基乙氧基）乙氧基]甲基]-苯氧基]-3-[（1-甲基乙基）胺基]-2-丙醇富馬酸鹽，分子式為（C18H31NO4)2·C4H4O4。其主要適應(yīng)癥為高血壓．冠心病（心絞痛）。伴有心室收縮功能減退（射血分數(shù)≤35%，根據(jù)超聲心動圖確定）的中度至重度慢性穩(wěn)定性心力衰竭。在使用本品前，需要遵醫(yī)囑接受ACE抑制劑、利尿劑和選擇性使用強心甙類藥物治療。比索洛爾因結(jié)構(gòu)中含有仲胺，可能會產(chǎn)生相應(yīng)的亞硝胺（NDSRI）雜質(zhì)，其亞硝胺雜質(zhì)N-亞硝基-比索洛爾結(jié)構(gòu)如下圖1，根據(jù)FDA發(fā)布的亞硝胺原料藥相關(guān)雜質(zhì)推薦可接受攝入量控制指南中記載N-亞硝基-比索洛爾AI（允許攝入量，Acceptable Intake）值為1500ng/天。
圖1 比索洛爾及其N-亞硝基-比索洛爾結(jié)構(gòu)圖
N-亞硝基-比索洛爾AI值為1500ng/天，結(jié)合富馬酸比索洛爾片已批準說明書規(guī)定的最大日劑量10mg/天計算，控制限度為150ppm。結(jié)合限度，開發(fā)了高效液相色譜法對富馬酸比索洛爾片中的亞硝胺雜質(zhì)N-亞硝基-比索洛爾進行測定，并且對方法采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3400系列配置紫外檢測器進行相應(yīng)的方法學(xué)驗證，包括：專屬性、線性、準確度、重復(fù)性、檢測限等，結(jié)果顯示該方法專屬、靈敏。
關(guān)鍵詞：比索洛爾；高效液相色譜法；亞硝胺雜質(zhì)
1.儀器設(shè)備及試劑
1.1液相配置清單
表1 高效液相色譜系統(tǒng)配置清單
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序號 |
名稱 |
數(shù)量 |
|
1 |
UV3400 紫外檢測器 |
1臺 |
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2 |
P3400B 二元高壓恒流泵 |
1臺 |
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3 |
CT3400 柱溫箱 |
1臺 |
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4 |
AS3400 全自動進樣器 |
1臺 |
|
5 |
SmartLab NetCDS 色譜使用工作站 |
1套 |
|
6 |
C18 250x4.6 mm，5 μm |
1個 |
1.2試劑及標準品清單
表2 試劑及標品清單表
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序列 |
試劑及對照品 |
純度 |
|
1 |
乙腈 |
HPLC級 |
|
2 |
磷酸二氫銨 |
AR級 |
|
3 |
磷酸 |
AR級 |
|
4 |
N-亞硝基-比索洛爾對照品 |
99.4% |
1.3實驗材料及輔助設(shè)備
超聲波清洗機；
渦旋混合器
2.實驗方法
2.1溶液配制
2.1.1 磷酸鹽緩沖液：稱磷酸二氫銨3.45g，加水900mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5，加水稀釋至1000mL。
2.1.2 溶劑：磷酸鹽緩沖液：乙腈=(85:15)。
2.1.3 線性溶液：取N-亞硝基-比索洛爾對照品適量，精密稱定加流動相溶解并稀釋至每1mL約含1000ng的溶液，作為標準貯備液母液；精密量取標準貯備液適量，加流動相定容至刻度線，搖勻，配制成濃度為15ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、100 ng/mL標準系列線性溶液。
2.1.4對照品溶液：取N-亞硝基-比索洛爾對照品適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋制成每1mL約含N-亞硝基-比索洛爾30ng的溶液，作為對照品溶液。
2.2樣品配制
2.2.1 樣品溶液
精密稱取富馬酸比索洛爾細粉（約相當于比索洛爾5mg）適量，置25mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋制成每1mL約含比索洛爾0.2mg的溶液，作為樣品溶液。用濾膜過濾后上機。
2.2.2 準確度溶液
精密稱取富馬酸比索洛爾細粉（約相當于比索洛爾5mg）適量，置25mL量瓶中，加入適量的N-亞硝基-比索洛爾對照品溶液，用流動相溶解并稀釋至刻度，配制成100%加標樣品，搖勻，即得，作為準確度溶液。用濾膜過濾后上機。
3實驗結(jié)果
3.1專屬性
圖2 專屬性測試譜圖
說明：溶劑不干擾N-亞硝基-比索洛爾檢測，供試品溶液中其他雜質(zhì)色譜峰亦不干擾N-亞硝基-比索洛爾雜質(zhì)測定。
3.2線性測試
圖3 N-亞硝基-比索洛爾雜質(zhì)測試色譜疊加圖
 |
說明：實驗結(jié)果顯示，N-亞硝基-比索洛爾雜質(zhì)測試線性相關(guān)系數(shù)R值在0.9999以上，滿足試驗要求。
3.3 重復(fù)性測試
圖5 6針30ng/mL標準品重復(fù)性測試譜圖
表3 6針30ng/mL標準品重復(fù)性測試數(shù)據(jù)
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化合物名 |
保留時間（min） |
|
N-亞硝基-比索洛爾 |
13.958 |
|
13.963 |
|
|
13.968 |
|
|
13.973 |
|
|
13.966 |
|
|
13.948 |
|
|
平均值 |
13.963 |
|
RSD（%） |
0.063 |
說明：由上表數(shù)據(jù)可知，N-亞硝基-比索洛爾保留時間重復(fù)性為0.063%，重復(fù)性良好。
3.4 準確度測試
圖6 片劑中N-亞硝基-比索洛爾準確度疊加圖
表4 富馬酸比索洛爾片準確度（N-亞硝基-比索洛爾）
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水平 |
已有量（ng） |
加入量（ng） |
測得量（ng） |
回收率（%） |
平均值（%） |
|
100% |
0.00 |
723.135 |
728.303 |
100.715 |
99.38 |
|
100% |
0.00 |
739.090 |
102.206 |
||
|
100% |
0.00 |
799.763 |
110.597 |
||
|
100% |
0.00 |
662.237 |
91.579 |
||
|
100% |
0.00 |
708.528 |
97.980 |
||
|
100% |
0.00 |
673.922 |
93.195 |
說明：6份樣品中N-亞硝基-比索洛爾的回收率在91.58~110.60%，平均回收率為99.38%，本方法檢測準確度良好。
3.5 檢測限測試
圖7 N-亞硝基-比索洛爾濃度為30ng/mL對照品測試譜圖
表5 N-亞硝基-比索洛爾濃度為30ng/mL對照品測試數(shù)據(jù)
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名稱 |
保留時間(min) |
峰面積(mAU*s) |
信噪比 |
|
N-亞硝基-比索洛爾 |
13.973 |
3.023 |
30.324 |
說明：根據(jù)上表N-亞硝基-比索洛爾濃度為30ng/mL對照品測測試數(shù)據(jù)，3倍信噪比為檢出限計算可知N-亞硝基-比索洛爾檢測限理論結(jié)果為2.9679ng/mL。
3.6 某廠家片劑測試
圖8 某廠家片劑測試譜圖
說明：某廠家片劑中未檢測出N-亞硝基-比索洛爾。
4．結(jié)論
根據(jù)FDA日前發(fā)布的藥物基質(zhì)亞硝胺雜質(zhì)（NDSRI，Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities）允許攝入量設(shè)定的指南文件對富馬酸比索洛爾片中亞硝胺雜質(zhì)N-亞硝基-比索洛爾進行研究。根據(jù)該文件計算AI（允許攝入量，Acceptable Intake）值均為1500ng/天，同時結(jié)合本品最大日劑量（10mg），在片劑中的控制限度為不得過150ppm。采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3400系列配置紫外檢測器進行相應(yīng)的方法學(xué)驗證。用已驗證的檢測方法對富馬酸比索洛爾片樣品進行檢測，未檢出亞硝胺雜質(zhì)N-亞硝基-比索洛爾。以上數(shù)據(jù)均滿足藥典方法對于儀器的要求。
相關(guān)產(chǎn)品
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